三代测序
三代测序简介
【添加时间:2016-09-05 09:17:49】【来源:】【作者:dggadmin】
       第三代测序技术是指单分子测序技术。测序不需要经过PCR扩增,实现了对每一条DNA分子的单独测序。主要代表为美国Pacific Biosescience公司的SMRT技术。脱氧核苷酸用荧光标记,显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候,其荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候,荧光基团就被DNA聚合酶切除,荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性,并且在荧光被切除之后,合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。最新推出的Sequel单分子测序平台保留了PacBio RS II长读取、均一覆盖和甲基化信息的优势,其测序通量是后者的7倍。
\
图1:PacBio RS II 测序仪

\
图2:PacBio Sequel测序仪
\
图3: SMRT技术建库流程

     第三代测序的技术特点是:
1、实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度,一秒可以测10个碱基,测序速度是化学法测序的2万倍。
2、实现了DNA聚合酶内在自身的延续性,一个反应就可以测非常长的序列(可以测几千个碱基
3、精度非常高,达到99.9999%。
4、直接测RNA的序列。以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序,将大大降低体外逆转录产生的系统误差。
5、第二个是直接测甲基化的DNA序列。DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板,DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间,可以判断模板的C是否甲基化。

      第三代测序的应用主要有三个方面:
      1. 基因组测序
由于具有读长长的特点,SMRT测序平台在基因组测序中能降低测序后的Contig数量,明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量,节省大量的时间。
       2. 甲基化研究
       SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法,聚合酶合成每一个碱基,都有一个时间段,而当模板碱基带有修饰时,聚合酶会慢下来,使带有修饰的碱基两个相邻的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的比值如果大于1,由此就可以推断这个位置有修饰。通过聚合酶动力学提供的信息,可直接检测到DNA甲基化,包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC),为表观遗传学研究打开了一条通路。
       3. 突变鉴定 (SNP检测)

       单分子测序的分辨率具有不可比拟的优势,而且没有PCR扩增步骤,就没有扩增引入的碱基错误,该优势使其在特定序列的SNP检测,稀有突变及其频率测定中大显身手。

\
图4 用三代测序技术研究细菌基因组和甲基化组



上一篇:第一页
下一篇:最后一页